如发现有乱码，请点击下面链接浏览原文
正文摘录:

·14·Journalo厂ClinicalcmdExperimentalMediciw％Z.7，舳.3Mar.2008tech，UK)标记在对照组总RNA逆转录的cDNA上，Cy5一durrP(Amershampharmaeiabiotech，uK)标记在各病人总RNA逆转录的cDNA上”0。1.3杂交、洗涤及扫描实验所用的细胞因子芯片是宝生物(大连)公司(TaKaRa公司)生产的人细胞因子芯片(Humancy—tokineChipVersion3.1)，内含553种人细胞因子及相关因子基因片段。操作按照TaKaRa功能基因芯片的操作手册进行。将芯片用杂交液[5×SS(：+0.5×甲酰胺+0.02~A，十二烷基硫酸钠(sDs)+阻断剂+1％NP40]42℃预杂交2d，盖玻片于无水乙醇室温浸泡lh以上。Cy3一dUrITP和Cy5一dUTP两种标记的cDNA}昆合物经纯化、变性后，在芯片上杂交，置于42~C恒温箱避光16h。室温下再用2×SSC／0.2％SDS55℃洗涤两次、2×SSC／’0.2％SDS65℃洗涤一次、0.05×SSC室温洗涤一次各5min，室温晾干。待芯片完全干燥后，用美国axon公司GenePix4000B扫描仪进行扫描，并用GenePix：Pro3.0把图像中荧光强度转换为数字信号，便于以后的数据校正和分析。1.4数据分析1.4.1数据的标准化根据美国T：[GR公司生产的MII)AS芯片分析软件包中标准化的原理一局部加权最小二乘法即Lc)WESS法，和GK等研究资料，应用数据处理软件MicrosoftExcel2003、SPSS13.0的“权重估计”分析，计算出LOWESS函数。设R为去除背景的Cy5一duTP标记的病人cDNA的荧光强度值，G为去除背景的Cy3一durrP标记的对照组cDNA的荧光强度值，获得校正后的log2R／G(即未校正前的log2R／G减去对应的LOWESS函数值)与荧光强度1／210g2(R×G)的散点图，以减少芯片实验系统误差HJ。1.4.2筛选表达有差异基因的标准应用国际常用的美国Stanford大学开发的芯片分析软件(Significanceanalysis0fmi.croalTay，SAM；version2.20a)来选择表达有显著性差异的基因。选取delta值为0.88，q值(相当于错误发现率(FalseDiscovery.Ratej)≤0.05，而且(：y5／cy3≥1.5或≤0.67，即2为底的对数值I＞0.585或≤一0.585的有意义基因作为表达有显著性差异的基因‘“。2结果2.1总RNA的提取病人及对照组的外周血单个核细胞总RNA电泳图如图1显示：28s和18s条带清晰，28s的量约是18s的两倍，无其他杂带，表明RNA纯度高，完整性好，无明显降解。此外，RNA0【)260／O【)280≥1.7，可以进行逆转录和芯片杂交。...——28x——18s图ll％琼脂糖凝胶中对照组和病人外周血的总RNA电泳图(M：DNA2000标记；1和2分别是对照组和病人外周血提取的总RNA)2.2芯片基因表达图谱及芯片检测的质量控制芯片扫描结果符合标准，信号强度强，点圆，大小均一，背景均一。每张芯片上的28个阳性对照、139空白对照和16个阴性对照均符合要求。见图2。图2房间隔缺损患者外周alltgtt~g因子的基因表达谱(A：样本0927。B：样本0928。C：样本0929)2.3差异表达的细胞因子的选取经过基因表达数据的标准化处理(图3)以及SAM软件分析后，在553种细胞因子及相关基因中，0927样本有7种细胞因子表达显著下调，0928样本有9种细胞因子表达显著下调，0929样有15种细胞因子表达显著下调，有趋化因子4((：XCR4／fusin)表达显著上调。其中B胸腺素一4和核糖体蛋白s5在3张芯片均表达下调，祖血小板碱性和血小板生长因子在0927和0929样品中下调。根据每种细胞因子的GenBank序列号，我们从PuBMED上获得相应的细胞因子的基因序列、结构及相关文章等信息；并将所涉及的细胞因子的功能等归纳于表2。