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正文摘录:

·18·JournalD，Clinic口zⅡ趔Experimental朋cd把iw％z.7.，vo.3Mar.2008RNA，将总RNA逆转录制备cDNA(反应体系参照Promega公司试剂说明)。以含有HKⅡ基因cDNA序列的pBluescriptSK+质粒(本实验室构建)为模板建立标准曲线。取同一样品的等量cDNA作为PCR模板，分别加入HKⅡ及3一磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde一3一phosphatedehydrogenase，GAPDH)的弓I物、探针，检测HKⅡ及GAPDH的表达水平，两者之比即为：HKⅡ在各细胞中的相对表达量。HKⅡ及GAPDH引物与Taqman探针由上海基康有限公司合成，序列如下：HKⅡ引物1：5’＞GAGCC3、.GAGGACATCA’FGG'1Tr＜3jHKⅡ弓l物2：5’＞G’丌A’FCCAT—GAAGlTrAGCCAGGCA＜3jHKⅡTaqman探针：FAM—AC一(~'CAGCTGmGACCACATFG~：CGA—TAMRA；GAPD[I弓I物1：5’＞GTCCGTGAAGG'rCGGAGTC＜3jGAPDH引物2：5’＞GAAGATG—GTGATGGGA’I’ITllCC＜3’GAPDHTaqman探针：JOE—GTTGCTI’c一(：CG‘FI'C~I’CATTC—TAMRA。1.6统计学方法实验结果用SPSS11.5软件处理，计量资料以均数±标准差(互±s)表示。组间差异比较采用单因素方差分析，P＜0.05有统计学意义。2结果2.1细胞周期分析SGC一’7901在缺氧环境中培养下，细胞周期分布发生了改变，G1期的细胞显著增加，处于G2／M期的细胞减少，并且可见到较明显的凋亡峰形成。两组缺氧组G1期细胞与对照组比较，差异有统计学意义(尸＜0.05)；缺氧24h组与缺氧12h比较中，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图1，表1。图1SGC一7901在缺氧环境下的细胞周期改变表lSGC一。7901缺氧不同时间下细胞周期分布比较(％。；±s)注：两组缺氧组与对照组比较，‘P＜0.05；缺氧24h组与缺氧12h组比较，’P＜O.05。2.2HIF一1d检测随着缺氧时间的延长，SGC一’7901细胞HIF一1仪表达增加，两组缺氧组与对照组比较，差异有统计学意义(尸＜0.05)；缺氧24h与缺氧12h比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。2.3HKⅡ检测由含有HKⅡ基因cDNA的质粒pBlue—scriptSK+依次10倍稀释成10’～10。cps／汕l等4个浓度梯度，经FQ—PCR后获得典型的倒“S”型曲线，可检测到荧光信号的起始循环数(ct)与模板浓度对数值的相关函数为y=一3.562ct+37.148，r2=0.9972，见图2。利用标准曲线检测HKⅡmRNA的表达量。随着缺氧时间的延长，SGC一。7901细胞HKⅡ基因的表达量逐渐增加，两组缺氧组与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；缺氧24h与缺氧12h比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。—’b1_—u—，k一h……～hh“h“、、__～，’’、一一一-一‘℃一“’、h。—u～_—-。-h。h～H。h1-——^‘＼、、。_H一＼{┗┻┻┻┻┻┻┻┛图2HKⅡFQ—PCR标准曲线图表2SG(：一7901缺氧不同时间下HI[r—la和HKⅡInRNA表达变化(；±s)注：’：两组缺氧组与对照组比较，P＜0.05；。：缺氧24h组与缺氧12h组比较，JP＜0.05。3讨论恶性肿瘤是一类细胞周期调控失调引起的疾病，研究表明缺氧可导致肿瘤细胞周期发生GO／G1期阻滞。同时，恶性肿瘤的一个常见表型是它们具有高度的糖分解代谢表型，即与正常组织相比较，它们能够把更多的葡萄糖代谢为乳酸。目前已经确认肿瘤细胞表现出的高度糖分解代谢表型是以肿瘤细胞内己糖激酶(HK)的高活性为基础的。HK是糖酵解途径中的第一个限速酶，能在ATP的参与下将葡萄糖转化为6一磷酸葡萄糖，其中HKⅡ和肿瘤的相关性最大。研究表明生长迅速的肿瘤细胞和正常细胞比较，HKⅡ活力明显升高，使肿瘤细胞能获得足够的6一磷酸葡萄糖，这是在缺氧条件下特别有意义的碳源和能源心]。实体肿瘤在发展过程中，因瘤体增大血液供应不足而产生缺氧，缺氧又能通过一个关键的转录因子一乏氧诱导因子。在肿瘤形成过程中一个关键的步骤是对缺氧的自身调节和适应，实体肿瘤普遍存在的缺氧环境是其对放化疗和免疫治疗产生耐受性的原因之一。乏氧诱导因子HIF—l(HIF一1)属bHI。H2PAS蛋白家族，是由HlF一10【和HIF一1p各两个亚单位组成的异二聚体。HIF—l是细胞对缺氧环境的主要调节因子，能在缺氧状态下诱导一系列低氧反应基因如血管内皮生长因子(VEGF)、促红细胞生成素(EP0)、糖酵解酶、血红素氧化酶(H0—1)、一氧化氮合成酶(NOs)等表达增加，提高机体对缺血缺氧的耐受。其中HIF’一1d对氧的依赖性较强，在正常氧分压情况下降解，当环境中的氧浓度下降时表达增加并稳定存在，且其表达增加表现在转录和蛋白水平，但主要是蛋白水平的表达改变”J。恶性肿瘤细胞因增殖活跃，能量需求远高于正常组织，但其可以通过改变自身的能量代谢途径从周围有氧或无氧环境中获得能量。目前已经发现肿瘤内存在乏氧细胞，乏氧存在能使肿瘤细胞的一些基因和蛋白的转录或表达增加，包括氧调节蛋白如血红素氧化酶和糖酵解酶、VEGF、EPO、p53和血小板源性生长因子2B(PDGF213)等¨’。，这些酶或因子表达的变化使肿瘤细胞在乏氧微环境下仍能增殖活跃，而HIF一1是调控上述基因表达的主要转录因子。本研究结果发现，人胃癌细胞SG(：一7901在缺氧条件下培养一段时间，出现明显的GO／G1期阻滞，这与文献报道一致，但其中机制尚不清楚。初步研究认为053是乏氧引起GO,／G1期阻滞的重要调节因子之一，缺氧可诱导ⅢFl0【通过Mdm2(Murinedoubleminute22，Mdm2)引起细胞p53表达上调陋J，053增高(下转第20页)