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正文摘录:

实验研究C…NESECoMMUNlwDOC∞PSsiRNA阻断NF—KB信号通路对肝癌细胞增殖的影响郝爱芹徐嘉455000河南省安阳市第五人民医院摘要目的：通过阻断肝癌细胞中NF—kappaB(NF—KB)信号通路，研究它与肿瘤细胞增殖、耐药的关系。方法：利用.RNA干扰(RNAi)技术阻断NF—s：B亚单位p65的表达，RT—PCR和Westernblot—tm’g法检测065的mRNA及蛋白表达，Mr丌法检测细胞的增殖情况，以及联合应用不同浓度化疗药5一Fu对肿瘤细胞增殖的影响。结果：NF—KB的亚单位p65在肝癌细胞质中高表达，p65siRNA可有效地阻断蛋白表达。结论：应用RNAi技术可以有效地干扰p65表达，抑制肝癌细胞增殖。增强对化疗药5一Fu的敏感性。关键词肝细胞癌NF—KBRNA干扰siRNA资料与方法细胞系及细胞培养：肝癌细胞系HepG2购自中国科学院上海生化所。细胞在含有10％胎牛血清，100U／ml青霉素，100ftg／ml链霉素的1640培养液((~ibco公司)中于3’7~C、5％C02条件下培养，实验细胞均处于对数生长期。抗体和试剂：鼠抗人p65(sc一8008)单克隆抗体和NF—KBp65siRNA干扰试剂盒购自SantaCruzBiote(：hnology公司，M丌购自Sigma公司。siRNA的转染：按照SantaCruzBio-technology公司siRNA干扰试剂盒说明书的要求，进行转染。在转染前，HepG2(5×10。)按一定细胞数铺于6孔板中，使用无抗生素的培养基培养24小时。将含有siRNA的转染试剂与细胞共孵育5小时后，加入新鲜培养基孵育24小时。再培养48小时后收集转染的和未转染的细胞，用RT—PCR和WesternBlotting检测p65mRNA及蛋白水平的变化。RT—PCR：分别合成p65和GAPDH的cDNA第一链。步骤如下：取总RNAlIxg，随机六合引物1“，5×AMVBuffer4¨l，RnaseInhibitor(20U／“1)1“l，dNTP(10mmoL／L)2p.1，AMVRTI“l，加’DEPC处理水至20IXl，稍离心后混匀，370c水浴60分钟，70℃水浴10分钟。从上述反应体系中取2Ixl，加10×PCRBuff：er5“l，2mmoL／LdNTPl“，25mmoL／LMgCl23斗l，50mmol,／L的引物各O.5斗l，1u／50IxlTaq酶1¨l，无菌水361xl，总体积为50山。反应体系为：940C预变性，2分钟后开始循环，95％变性1分钟，57℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，30个循环，最后72℃延伸5分钟。胞浆蛋白的制备：按照细胞质蛋白提取试剂盒说明书(I)ierce公司)，提取细胞质蛋白，Brad‰rd法检测蛋白质的含量，一70℃保存。westemBlotting测定蛋白的表达：从HepG2细胞中取胞质蛋白，与预染的蛋白质分子量标准一起上样。检测p65蛋白表达，经12％SDs—PAGE分离，电转到硝酸纤维膜上。5％脱脂奶粉TBsT溶液封闭2小时，抗体按l：100孵育4℃过夜，TBsT溶液洗涤10分钟×3次，硝酸纤维膜分别与辣根过氧化物酶标记的二抗(1：50000)室温孵育l小时后，TBSq’溶液洗涤10分钟×3次，DAB显色。实验重复3次。细胞增殖实验的检测：转染后的HepG2细胞和未转染的对照细胞，将细胞浓度调为l×10。／m1，接种于96孔板中，每孔200ILl，平行5孔，置于37qC，CO，培养箱中培养。实验设空白对照组和sir.NA干扰组，分别于24、48和72小时加入M.rr20lxI，继续培养4小时后弃上清，每孔加入200lxIDMSO，震荡15分钟，在酶标仪上读出吸光值。统计学处理：数据用x±s表示，用SPSSl0.0进行￡检验，检验水准o【=O.05、结果RT一’PCR扩增HepG2细胞065基因的cDNA片段：HepG2细胞总。RNA经变性凝胶电泳和测260nmC)D值检验，总RNA的提取质量较好。.Hep(卫细胞转染siRNA0和72小时后，RT—PCR法检测细胞中p65mRNA表达水平。结果显示，转染后的}lepG2细胞，p65mRNA的表达水平下调.提示：在肝癌细胞中，p65siRNA可以特异性地降解p65mRNA。细胞转染siRNA后各组065蛋白的表达水平：HepG2细胞转染siRNA48和72小时后，收集细胞提取蛋白，用West-elTIB】ottmg法检测细胞中p65的蛋白表达水平。实验结果表明，HepG2细胞转染4中国社区医师·医学专业半月干r12008年第7期(第10k总第184期后p65蛋白的表达水平下调，而非抑制蛋白MAPK的表达无影响。说明针对065的siRNA可特异性地抑制p65的表达，对其他蛋白的表达无影响。p65特异性siRNA对}lepG2细胞增殖的影响：在转染后24、48和72小时分别检测转染组和未转染组细胞的生长情况，siRNA干扰组和对照组的A值在48和72小时均有显著性差异(.p＜0.05)。讨论在本实验中，我们证实了在肝癌细胞系中，存在高表达的NF—KB亚单位p65，并且活化的NF—KB在肝癌细胞的生存和增殖中起着重要作用。p65siRNA可引起特异性的基因沉默，有效地阻断活化的NF—KB的信号通路，并增强肿瘤细胞对化疗药的敏感性。由于激活的NF—KB信号通路在肿瘤的发生发展及抗凋亡中起着重要的作用，因此阻断NF—KB的信号通路将为基因治疗提供一个较好的靶点。参考文献lPhanlLV..ritm~0AT.Y0shirnuraLclnhibi—lion0fconslltuliveNF—KBactl',riJ.It’oninman—tIecelllymphomaBcellsleadst0inducli’on0fceUcycle.：ti,Te,standapoptosisJInmlunol，2003.171188—952月全国报告3例人禽流感病例卫生部3月H日公布了2008年2月全国法定传染病疫情。从2008年2月1日零时至2月29日24时，全国(不舍台港澳)共报告甲、乙类法定传染病发病261028例，死亡662人徐鼠疫、霍乱、待染性非典型肺炎、脊髓灰质炎和白喉无发病、死亡痛倒报告外。其余22种甲、乙类传染病均有报告。报告发病敷居前5位的病种依次为肺结核、乙肝、麻疹、梅毒和痢痰，占甲、乙类传染病报告发病总数的88.40％。报告死亡敷居前5位的病种依次为艾滋病、肺结核、狂犬病、乙型肝炎、流脑。占甲、乙类传染病报告死亡总教的88.82％。2月全国报告3倒人感染离致病性禽流感确诊病例，全部死亡。同期，全国(不合台港澳)县报告丙类法定传染病发病44590侧，死亡6倒。报告发嫡数居前3位的病种依次为其他感染性腹泻痛、流行性腮腺炎和流行性感冒，占丙类传染病报告发病总数的92.’72％。(钱峰)